Nanotechnologische Funktionalisierung für Diagnose und Sicherheit in der Lebensmittelkette und im Gesundheitswesen

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Fachhochschule Flensburg

Fachhochschule Flensburg, Fachbereich Biotechnologie

Service

Analytische Anwendungen der Durchflusszytometrie

Die Arbeitsgruppe ist auf den Nachweis und die Charakterisierung von Mikroorganismen mit Hilfe durchflusszytometrischer Methoden spezialisiert. Anwendungsgebiete sind z.B. Qualitätskontrolle und Prozessoptimierung in der Lebensmittelindustrie und Optimierung der Biogasproduktion. Es werden Methoden entsprechend der Anforderungen der Kunden entwickelt und durchflusszytometrische Techniken, die in der Forschung schon länger etabliert sind, in die Routineanalytik der biotechnologischen Industrie übertragen.
FCM (Flow Cytometry Measurement) wurde bisher vor allem im medizinischen Bereich zur Charakterisierung von Zellen des Blutsystems eingesetzt. Mit der Verfügbarkeit von hinreichend starken Lichtquellen (Laser) und empfindlicheren Detektoren lassen sich jetzt auch Zellen der wesentlich kleineren Bakterien untersuchen. Im Durchflusszytometer werden die als Suspension vorliegenden Zellen durch eine hydrodynamische Fokussierung separiert und sequentiell per Laserstrahl angeregt. Das Zytometer kann je nach Ausstattung und Vorbereitung der Probe mehrere funktionelle und strukturelle Parameter simultan messen. Die FCM-Technik in Kombination mit Fluoreszenzmarkierung ist eine effektive Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von zellulären Parametern.
 
Detektion von mikrobiellen Kontaminanten

Eine wichtige Anwendung in der biotechnologischen Industrie ist der Nachweis von mikrobiellen Kontaminanten in großen Probenvolumina auch in Anwesenheit einer hohen Anzahl von Nutzorganismen. Zwar ist die bisherübliche zeitaufwändige Standardmethode (selektive Anzucht, Plattierung) inzwischen durch molekularbiologische Nachweisverfahren (PCR) ergänzt worden, aber auch hiermit lässt sich nur die bloße Anwesendheit der Keim-DNA nachweisen und quantifizieren, nicht jedoch der Anteil tatsächlich vermehrungsfähiger Zellen ableiten. Genau dieses kann jedoch die Durchflusszytometrie leisten. Neben dem qualitativen und quantitativen Nachweis ermöglicht sie auch die Bestimmung der Vitalität der Kontaminanten. Um eine niedrige Nachweisgrenze zu erreichen, kann ein Anreicherungsschritt vorgeschaltet werden: die Kontaminanten werden mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern an Magnetpartikel immobilisiert, dann aus der Probe extrahiert und durchflusszytometrisch nachgewiesen. Diese Methode ermöglicht den Nachweis von Kontaminanten auch in komplexen Proben und Zellmischungen wie Milch, Käse, Joghurt und Fermenterproben.
Vorteile der Methoden:
• Qualitativer & quantitativer Nachweis
• Bestimmung der Vitalität (lebend, geschädigt, tot)
• Verfahren ist an unterschiedliche Prozessbedingungen anpassbar
• Hohe Probendurchsätze durch Automatisierbarkeit möglich
• Sensitiv und schnell: Ergebnisse liegen in 0,5 – 1,5 h vor
• Niedrige Kosten und einfaches Handling

Plattieren: nur vermehrungsfähige Zellen können detektiert werden; Durchflusszytometrie: lebende, lebende aber nicht vermehrungsfähige und tote Zellen
 
FCM in Kombination mit Fluoreszenztechniken ist eine effektive Methode für die simultane Charakterisierung und Quantifizierung von strukturellen und funktionellen Zellparametern wie Membranintegrität, Enzymaktivität, Membranpotential und intrazellulärer pH-Wert. Vergleiche zwischen FCM und konventionellen Plattentests haben gezeigt, dass oft ein großer Anteil der Zellen nicht mit Plattentests detektierbar ist, da nur vermehrungsfähige Zellen detektiert werden können. Es ist jedoch bekannt, dass bei vielen Kulturen bis zu 60% der vitalen Zellen einer Kultur nicht vermehrungsfähig sind und somit nicht mehr mittels der Standardmethode nachgewiesen werden können. Diese Bakterien können aber trotzdem mit ihrer Enzymaktivität einen Fermentationsprozess beeinflussen. FCM ermöglicht also eine aussagekräftigere Analyse des physiologischen Zustands von Einzelzellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Produktionsprozesses. Es können relative und absolute Zellzahlen der vitalen, toten und geschädigten Zellen in Fermenterproben innerhalb von ~15 Minuten ermittelt werden. Im Vergleich mit herkömmlichen mikrobiologischen Methoden, die 3-5 Tage dauern können, bedeutet dies eine entscheidende Reduzierung der Analysezeit und ermöglicht eine schnelle Anpassung der Prozessbedingungen.


Lab-on-Chip-Technologie für die schnelle Detektion von mikrobiellen Kontaminationen in der Lebensmittelindustrie


Als Partner des dreijährigen INTERREG IV A Projektes „Lab-on-chip“ entwickelt die Fachhochschule Flensburg gemeinsam mit den Partnern der Syddansk Universitet in Sonderborg, Dänemark und der Fachhochschule Kiel ein Lab-on-chip-Mikrosystem, das die frühe Entdeckung von Mikroorganismen in festen und flüssigen Matrices der biotechnologischen Industrie ermöglicht. Diese Technologie kann in verschiedenen Bereichen wie z. B. in der Lebensmittelverarbeitung und der Arzneimittelherstellung angewandt werden, um unerwünschte und schädliche Mikroorganismen in einem frühen Stadium erkennen zu können.


Hintergrund
Ein großes Problem in der Lebensmittelverarbeitung und Arzneiherstellung ist der Nachweis von mikrobiellen Kontaminanten. Schon wenige Mikroorganismen können in kurzer Zeit große Mengen eines Lebensmittels ungenießbar machen oder vergiften und die Produktion von Medikamenten gefährden. Die Verwendung kontaminierter Produktionslots stellt ein großes Risiko für die Lebensmittelindustrie und den Endverbraucher dar. Daher sind sichere und schnelle Nachweismethoden von essentieller Bedeutung.
Viele Kontaminationen können mit den bisher verwendeten Nachweismethoden erst nach mehreren Tagen festgestellt werden. Für einen Eingriff in das Produktionsverfahren zur Abwendung größerer Schäden ist es dann jedoch zu spät. Daher besteht seitens der Industrie großes Interesse an der Entwicklung neuer Methoden, mit denen Kontaminationen schon in frühem Produktionsstadium erkannt werden. Zwar ist die bisher übliche zeitaufwendige Standardmethode (selektive Anzucht, Ausplattieren) durch gentechnische Nachweisverfahren (PCR) ergänzt worden, aber hiermit lässt sich allein die Anwesenheit der Kontaminanten-DNA nachweisen, nicht jedoch die Anzahl tatsächlich vitaler Zellen. Das genau ist ein Merkmal der Durchflusszytometrie, die nicht nur die Detektion von Einzelzellen (>2000/s), sondern auch ihre Identifizierung, Quantifizierung und die Bestimmung der Vitalität ermöglicht.

 

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